超實(shí)用的幾種細(xì)胞膜熒光探針的染色細(xì)節(jié)解析：

    DiA，DiI，DiO，DiD 和DiR 染料是用于標(biāo)記細(xì)胞膜和其他疏水結(jié)構(gòu)的親脂熒光染料家族。當(dāng)摻入膜中或與親脂性生物分子如蛋白質(zhì)結(jié)合時(shí)，這些對(duì)環(huán)境敏感的染料的熒光大大增強(qiáng)，盡管它們?cè)谒惺侨鯚晒獾?。它們具有高消光系?shù)，極性依賴性熒光和短激發(fā)態(tài)壽命。一旦應(yīng)用于細(xì)胞，這些染料在細(xì)胞質(zhì)膜內(nèi)橫向擴(kuò)散，導(dǎo)致整個(gè)細(xì)胞在其*佳濃度下均勻染色。 DiI（橙色熒光），DiO（綠色熒光），DiD（紅色熒光）和 DiR（深紅色熒光）的獨(dú)特?zé)晒忸伾珵榛罴?xì)胞的多色成像和流式細(xì)胞分析提供了便利的工具。 DiO 和 DiI 可分別與標(biāo)準(zhǔn) FITC 和 TRITC 過(guò)濾器一起使用。其中 DiD 被 633 nm He-Ne 激光器激發(fā)，細(xì)胞膜熒光探針具有比 DiI 更長(zhǎng)的激發(fā)和發(fā)射波長(zhǎng)，為標(biāo)記具有顯著內(nèi)在熒光的細(xì)胞和組織提供了有價(jià)值的替代方案。由于紅外光通過(guò)細(xì)胞和組織的有效傳輸以及紅外范圍內(nèi)的低水平自發(fā)熒光，DiR 可用于體內(nèi)成像或示蹤。

樣品方案分析

  1.制備DiO，DiI DiD，DiS或DiR膜染色溶液：

  1.1制備DMSO或EtOH儲(chǔ)備溶液：儲(chǔ)備溶液應(yīng)在DMSO或EtOH中以1-5mM制備。

  注意：原液的未使用部分應(yīng)儲(chǔ)存在-20℃。 避免反復(fù)凍/融循環(huán)。

  1.2準(zhǔn)備工作溶液：將原液（步驟1.1）稀釋到合適的緩沖液中，如無(wú)血清培養(yǎng)基，HBSS或PBS，制成1至5 M工作溶液。

  注意：對(duì)于不同的細(xì)胞類型和/或?qū)嶒?yàn)條件，應(yīng)根據(jù)經(jīng)驗(yàn)確定工作溶液的*終濃度。 建議在至少超過(guò)十倍范圍的濃度下進(jìn)行測(cè)試。

  2.將細(xì)胞染成懸浮液：

  2.1在染料加工溶液中懸浮細(xì)胞密度為1×106 / mL（來(lái)自步驟1.2）。 2.2在37°C溫育2-20分鐘。 *佳培養(yǎng)時(shí)間取決于細(xì)胞類型。 首先孵育20分鐘，然后根據(jù)需要進(jìn)行優(yōu)化以獲得均勻的標(biāo)記。

  2.3將標(biāo)記的懸浮管以1000至1500rpm離心5分鐘。

  2.4取出上清液，輕輕地將細(xì)胞重新懸浮在預(yù)熱（37°C）的生長(zhǎng)培養(yǎng)基中。

  2.5按步驟2.3和2.4再洗兩次。

  3.染色貼壁細(xì)胞：

  3.1在無(wú)菌玻璃蓋玻片上生長(zhǎng)貼壁細(xì)胞。

  3.2從生長(zhǎng)培養(yǎng)基中取出蓋玻片，輕輕地排出多余的培養(yǎng)基。 將蓋玻片放在濕度箱中。

  3.3將100μL染料工作溶液（來(lái)自步驟1.2）移至蓋玻片的角上，輕輕攪拌直至所有細(xì)胞都被覆蓋。

  3.4將蓋玻片在37°C孵育2-20分鐘。 *佳培養(yǎng)時(shí)間取決于細(xì)胞類型。首先孵育20分鐘，然后根據(jù)需要進(jìn)行優(yōu)化以獲得均勻的標(biāo)記。