注1:整個(gè)綴合過程可以在當(dāng)天內(nèi)完成。但是，綴合前對 PE 的純化可能需要24-48小時(shí)。除了下面列 出的材料外，您還需要濃度至少為 2 mg/ml 的抗體溶液。請您在進(jìn)行PE 抗體綴合實(shí)驗(yàn)之前熟悉如何使用脫鹽柱以及如何獲取吸光度光譜。
注 2 : SMCC-PE 綴合物非常穩(wěn)定 (在“交換緩沖液”中，在4C 下至少可以穩(wěn)定幾個(gè)月)。因此， 如果您需要節(jié)省一部分時(shí)間，可以選擇同時(shí)綴合10 毫克或更多的 PE, 并將其用于幾次抗體實(shí)驗(yàn)(在幾周內(nèi))。 SMCC-PE 的長期儲(chǔ)存好是作為飽和硫酸銨沉淀物。
一 .P E 的 制 備
1.將 PE 純化。綴合前的濃度通常為 5-10 mg/ml 。 注意： PE 在綴合前作為 SAS ( 硫 酸 銨 鈉 ) 沉淀物穩(wěn)定。如果將 PE 以SAS 沉淀物的形式儲(chǔ)存，則必須在使用前進(jìn)行大量純化。
2.使用3 .5毫克R-PE 修飾每毫克lgG, 包括在緩沖液交換過程中損失的額外10%。
3. 檢查 PE的純度和濃度，請測量280、565 和 6 2 0 nm 處的吸光度。 (1mg/ml 的 PE 在 565nm 處的 OD 為 8 . 2 ) 。 5 6 5 / 6 2 0 比 率 > 5 0 表示已充分去除污染的藻藍(lán)蛋白；565/280 比 率 > 5 表示已充分去除所有其他蛋白質(zhì)。
二 .P E 的 活 化
1.使用前在無水 DMSO 中制備 10 mg/ml 的 SMCC 儲(chǔ)備溶液。
2.每毫克 PE 加 入 1 1 μlSMCC, 并進(jìn)行渦旋。將反應(yīng)管用鋁箔包好，室溫下旋轉(zhuǎn)60 分鐘。
3.將純化的 PE 過凝膠過濾柱來交換緩沖液。
注意：對于失敗或效果較差的結(jié)合，增加或減少 SMCC 相對于 PE 的量，可能會(huì)有所好轉(zhuǎn)。
三 . 1gG 還 原
1.在蒸餾水中制備 1 M DTT(15.4mg/100 μl) 的新鮮溶液。
2.1gG 溶液濃度應(yīng)為 4 mg/ml 或更高，這樣效果比較好。還原幾乎可以在任何緩沖液中進(jìn)行； MES 、磷酸鹽和 TRIS 緩沖液 (pH 范圍為 6 至8)已被驗(yàn)證可以使用。如果抗體濃度低于 2 mg/ml, 則應(yīng)濃縮。緩沖液交換柱上的損失應(yīng)額外增加10%。
3.用 DTT 配制 20 mMlgG 溶液：每毫升 IgG 溶液加入 20μ lDTT 原液并攪拌。室溫下靜置30分鐘，無需額外攪拌 (以盡量減少半胱氨酸再氧化為胱氨酸)。
4.將還原的lgG 通過預(yù)平衡的“交換緩沖液”過濾柱。收集0.25毫升的級分，測定蛋白濃度，并將含有大部分lgG 的級分匯集在一起?？梢酝ㄟ^分光光度法或比色法完成。
5.此步驟后盡快進(jìn)行綴合。
注意：對于結(jié)合較差或失敗的情況，降低 DTT 濃度可能會(huì)有所幫助。
四 .進(jìn) 行 綴 合
1.每毫克 IgG 添 加 3.2 毫克 SMCC-PE。用鋁箔包裹反應(yīng)管并在室溫下旋轉(zhuǎn)60 分鐘。注意：這些摩 爾 比 ( 每 IgG 約 2 個(gè) PE) 效果很好。對于失敗或效果不佳的結(jié)合，不同的摩爾比可能會(huì)有所幫助。
2.60 分鐘后，必須去掉 lgG 上未反應(yīng)的游離巰基。
3.在 1.0 ml 干 DMSO 中制備 10 mg NEM 的新鮮溶液。
4.每 毫 克 |gG 添加 34μ g(3.4μl) 。室溫下包裹并旋轉(zhuǎn)20 分鐘。
2.60 分鐘后，必須去掉 lgG 上未反應(yīng)的游離巰基。
3.在 1.0 ml 干 DMSO 中制備 10 mg NEM 的新鮮溶液。
4.每毫克 |gG 添加 34μ g(3.4μl) 。 室溫下包裹并旋轉(zhuǎn)20 分鐘。