簡介

熒光素是非常流行和多功能的生物發(fā)光底物。螢火蟲熒光素酶/熒光素生物發(fā)光系統(tǒng)存在于螢火蟲（Photinus pyralis）和其他幾種甲蟲中。熒光素酶通過二氧雜環(huán)丁酮中間體氧化ATP活化的熒光素。螢火蟲熒光素酶通過熒光素的ATP依賴性氧化產(chǎn)生光。來自該反應(yīng)的560nm化學(xué)發(fā)光在數(shù)秒內(nèi)達到峰值，當(dāng)熒光素和ATP過量存在時，光輸出與熒光素酶活性成比例。螢火蟲熒光素酶長期以來與抗體結(jié)合，并在熒光素作為檢測底物的**測定中用作標(biāo)記物。與HRP和堿性磷酸酶相比，熒光素酶對化學(xué)修飾的耐受性較差。該酶的一個特別優(yōu)點是除了其高靈敏度之外，在哺乳動物組織中存在低內(nèi)源熒光素酶活性。熒光素酶的另一個重要用途是衛(wèi)生監(jiān)測領(lǐng)域。熒光素酶/熒光素系統(tǒng)可用于檢測污染，因為存在于所有生物體中的ATP需要產(chǎn)**光。這種ATP生物發(fā)光的主要應(yīng)用是通過測試食品加工廠的表面來確定質(zhì)量，以確定是否存在設(shè)備或產(chǎn)品的污染。

基本信息

儲存方式：

儲存在-20°C干燥。 避免光線。 到期日為自收到之日起一年。

操作步驟

注1：D-熒光素鹽易溶于水緩沖液，高可達100 mM。 儲備溶液可以在不含ATP的水中制備，并儲存在-20°C，避光。 必須用適當(dāng)?shù)膲A中和游離酸以溶解。

注2：D-熒光素可與任何現(xiàn)有的報告分析或ATP分析系統(tǒng)一起使用。

注3：如果測試ATP，請戴上手套并使用無ATP容器，盡量減少所有可能的ATP污染源。 僅使用無菌無ATP水和試劑。 所有試劑制劑均使用高壓**水。

以下方案是鉀鹽和鈉鹽制備的一個例子，它可以適用于大多數(shù)細(xì)胞類型和體內(nèi)動物用途。

1.用于體外生物發(fā)光圖像測定的示例性方案

1.1。 在無菌水中制備100mM（100-200X）熒光素原液。 好好混合。 立即使用，或單獨使用等分試樣，并儲存在-20°C，避免凍融循環(huán)，避免暴露在光線下。

1.2。 在預(yù)熱的組織培養(yǎng)基中制備0.5-1mM的D-熒光素工作溶液。

1.3。 從培養(yǎng)細(xì)胞中吸出培養(yǎng)基。

1.4。 將熒光素工作溶液添加到細(xì)胞中，并在成像前將細(xì)胞在37℃下孵育5-10分鐘。

2.用于體內(nèi)生物發(fā)光圖像測定的示例性方案

2.1。 在DPBS中制備15mg / mL熒光素儲備溶液混合均勻，不含Mg2 +和Ca2 +。

2.2。 過濾器通過0.2μm過濾器對溶液進行**。立即使用，或單獨使用等分試樣，并儲存在-20°C，避免凍融循環(huán)，避免暴露在光線下。

2.3。在動物體重150mg / kg（或10μL/ g熒光素儲備溶液）成像前10-15分鐘腹膜內(nèi)（i.p.）注射熒光素。

注意：應(yīng)對每種動物模型進行熒光素的動力學(xué)研究，以確定峰值信號時間。

3.熒光素報道分子測定的示例方案

3.1。 在無菌水中制備100mM熒光素儲備溶液。立即使用，或單獨使用等分試樣，并儲存在-20°C，避免凍融循環(huán)，避免暴露在光線下。

3.2。 制備1mM D-熒光素的工作溶液，其中含有3mM ATP，1mM DTT和15mM MgSO 4的25mM tricine緩沖液，pH7.8。

3.3。 移取5-10μl細(xì)胞裂解物到微量培養(yǎng)板中。 使用不含裂解液的裂解試劑或緩沖液作為空白。

3.4。 根據(jù)制造商的說明，使用熒光素工作溶液的Prime光度計。

3.5。 注入200μl熒光素工作溶液，沒有延遲和10秒的積分時間。

參考文獻

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