簡(jiǎn)要總結(jié)

準(zhǔn)備NADP / NADPH反應(yīng)混合物（50μL）®

添加NADPH標(biāo)準(zhǔn)品或測(cè)試樣品（50μL）®

在室溫下孵育15分鐘至2小時(shí)®®

監(jiān)測(cè)460 nm處的吸光度

注意：在開(kāi)始實(shí)驗(yàn)之前，在室溫下解凍每個(gè)試劑盒組分中的一個(gè)

步驟

1.準(zhǔn)備NADPH原液：

將200μLPBS緩沖液加入到NADPH標(biāo)準(zhǔn)品（組分C）的小瓶中以制備1mM（1nmol /μL）NADPH儲(chǔ)備溶液。

注意：未使用的NADPH原液應(yīng)分成單次使用的等分試樣并儲(chǔ)存在-20 oC。

2.制備NADP / NADPH反應(yīng)混合物：

2.1將8 mL NADPH探針緩沖液（組分B-II）加入到NADP / NADPH回收酶混合物（組分A）的瓶中，并充分混合。

2.2將2 mL NADPH探針（組分B-I）加入上述瓶中（來(lái)自步驟2.1）并充分混合。

注意：這種NADP / NADPH反應(yīng)混合物足以進(jìn)行200次分析。 未使用的NADP / NADPH反應(yīng)混合物應(yīng)分成一次性等分試樣并儲(chǔ)存在-20℃。

3.準(zhǔn)備NADPH標(biāo)準(zhǔn)品的連續(xù)稀釋液（0至2μM）：

3.1將2μL的1mM NADPH儲(chǔ)備液（來(lái)自步驟1）加入998μLPBS緩沖液（pH 7.4）中，得到2μM（2 pmols / L）NADPH標(biāo)準(zhǔn)溶液。

注意：稀釋的NADPH標(biāo)準(zhǔn)溶液不穩(wěn)定，應(yīng)在4小時(shí)內(nèi)使用。

3.2取200μL的2μMNADPH標(biāo)準(zhǔn)溶液（來(lái)自步驟3.1）進(jìn)行1：2連續(xù)稀釋，得到1，0.5,0.25,0.125,0.0625,0.0313和0mM系列稀釋的NADPH標(biāo)準(zhǔn)品。

3.3如表1和2中所述，將NADPH標(biāo)準(zhǔn)品和含有NADP / NADPH的測(cè)試樣品的系列稀釋液加入白色/透明底96孔微量培養(yǎng)板中。

注意：根據(jù)需要準(zhǔn)備細(xì)胞或組織樣本。 為方便起見(jiàn)，裂解緩沖液（組分D）可用于裂解細(xì)胞。 （詳見(jiàn)附錄）。

表1：白色/透明底96孔微孔板中NADPH標(biāo)準(zhǔn)品和測(cè)試樣品的布局

注意：NS = NADPH標(biāo)準(zhǔn)，BL =空白對(duì)照，TS =測(cè)試樣品。

表2：每個(gè)孔的試劑組成

*注意：將連續(xù)稀釋的NADPH標(biāo)準(zhǔn)品（0.0313μM至2μM）加入NS1至NS7的孔中，一式兩份。 高濃度的NADPH（例如，>30μM，濃度）將導(dǎo)致飽和信號(hào)并使校準(zhǔn)曲線非線性。

4.在上清液反應(yīng)中運(yùn)行NADPH測(cè)定：

4.1將50μL的NADP / NADPH反應(yīng)混合物（來(lái)自步驟2.2）加入NADPH標(biāo)準(zhǔn)品，空白對(duì)照和測(cè)試樣品的每個(gè)孔中（參見(jiàn)步驟3.3），使總NADP / NADPH測(cè)定體積為100μL/孔

注1：對(duì)于384孔板，每孔加入25μL樣品和25μLNAP/ NADPH反應(yīng)混合物。

注2：根據(jù)需要準(zhǔn)備細(xì)胞或組織樣本。 為方便起見(jiàn)，裂解緩沖液（組分D）可用于裂解細(xì)胞。 （詳見(jiàn)附錄）。

4.2在室溫下孵育反應(yīng)15分鐘至2小時(shí)，避光。

4.3使用吸光度讀板儀在460 nm處監(jiān)測(cè)吸光度的增加。

數(shù)據(jù)分析

空白孔中的吸光度（僅用PBS緩沖液）用作對(duì)照，并從具有NADPH反應(yīng)的那些孔的值中減去。 NADPH標(biāo)準(zhǔn)曲線如圖1所示。

圖1。 使用SpectraMax酶標(biāo)儀（Molecular devices），在96孔白色/透明底板中用Amplite TM比色總NADP和NADPH測(cè)定試劑盒*增強(qiáng)靈敏度*測(cè)量NADPH劑量反應(yīng)。 孵育1小時(shí)（n = 3）可以檢測(cè)到低至0.03μM的NADPH，在460nm處測(cè)量吸光度。

附錄：使用組分D（裂解緩沖液）的測(cè)試樣品制劑

1.植物細(xì)胞樣品：用200mg / mL的裂解緩沖液均質(zhì)化，并以2500rpm離心5-10分鐘，使用上清液進(jìn)行測(cè)試。

2.**細(xì)胞樣品：離心收集**細(xì)胞（（10,000 g，0°C，15 min）。使用約1億至1千萬(wàn)細(xì)胞/ mL裂解緩沖液，將處理后的溶液在室溫下保持15分鐘.2500℃離心 轉(zhuǎn)速5分鐘，用上清液進(jìn)行試驗(yàn)。

3.哺乳動(dòng)物細(xì)胞樣品：從平板孔中取出培養(yǎng)基，每1-5百萬(wàn)個(gè)細(xì)胞使用約100μL裂解緩沖液（或在96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中使用50-100μL/孔），并將處理過(guò)的溶液保持在室溫下 15分鐘。 直接使用細(xì)胞裂解液或以1500 rpm離心5分鐘，使用上清液進(jìn)行測(cè)試。

4.組織樣品：稱取約20mg組織，用冷PBS洗滌。 在微量離心管中用400μl裂解緩沖液均化。 以2500rpm離心5-10分鐘，使用上清液進(jìn)行測(cè)定。

參考文獻(xiàn)

1. Eugenia Villa-Cuesta, Marissa A. Holmbeckand David M. Rand. Journal of Cell Science (2014) 127, 2282–2290 doi:10.1242/jcs.142026.

2. Chao Tong, Alex Morrison, Samantha Mattison, Su Qian, Mark Bryniarski, Bethany Rankin, Jun Wang, D. Paul Thomas, and Ji Li. FASEB J, Nov 2013; 27: 4332 - 4342.

3. Rubin Tan, Jiansha Li, Xiaochun Peng, Liping Zhu, Lei Cai, Tao Wang, Yuan Su, Kaikobad Irani, and Qinghua Hu. Cardiovasc Res, Oct 2013; 100: 19 - 27.

4. Stephen Y. Xue, Valeria Y. Hebert, Danicia M. Hayes, Corie N. Robinson, Mitzi Glover, and Tammy R. Dugas. Toxicol. Sci., Aug 2013; 134: 323 - 334. 5. Kate J. Roberts, Andrew Cross, Olga Vasieva, Robert J. Moots, and Steven W. Edwards. J. Leukoc. Biol., Sep 2013; 94: 481 - 492.

5. Weijing Cai, Maya Ramdas, Li Zhu, Xue Chen, Gary E. Striker, and Helen Vlassara. PNAS, Sep 2012; 109: 15888 - 15893.

6. Yue Qiu, Claus Tittiger, Claude Wicker-Thomas, Ga?lle Le Goff, Sharon Young, Eric Wajnberg, Thierry Fricaux, Nathalie Taquet, Gary J. Blomquist, and René Feyereisen. PNAS, Sep 2012; 109: 14858 - 14863.

8. Jaime Uribarri, Weijing Cai, Maya Ramdas, Susan Goodman, Renata Pyzik, Xue Chen, Li Zhu, Gary E. Striker, and Helen Vlassara. Potential role of AGER1 and SIRT1. Diabetes Care 2011; 34: 1610 - 1616.