D-熒光素是流行的多功能生物發(fā)光底物。螢火蟲熒光素酶/熒光素生物發(fā)光系統(tǒng)存在于螢火蟲（Photinus pyralis）和其他幾種甲蟲中。熒光素酶通過二氧雜環(huán)丁酮中間體氧化ATP進(jìn)行活化熒光素。螢火蟲熒光素酶通過熒光素的ATP依賴性氧化產(chǎn)生光。來自該反應(yīng)的560nm化學(xué)發(fā)光在數(shù)秒內(nèi)達(dá)到峰值，當(dāng)熒光素和ATP過量存在時(shí)，光輸出與熒光素酶活性成比例。
問：D-熒光素鉀鹽溶液的穩(wěn)定性如何？可保存多久？
答：1.D-熒光素鉀鹽易溶于水和緩沖液，溶解度可高達(dá)25mg/mL。一般使用濃度為3-15 mg/mL。
2.溶液的pH值、溶液中的氧氣和保存時(shí)間對(duì)其保存過程中的穩(wěn)定性非常重要。當(dāng)溶液的pH<6.5（發(fā)生水解作用）或>7.5（發(fā)生消旋化作用，D型轉(zhuǎn)化為L(zhǎng)型）的情況下，D-熒光素鉀鹽相對(duì)不穩(wěn)定。如果溶液中存在少量的氧氣，將加速D-熒光素鉀的降解速度。
3.D-熒光素配成溶液后，在佳的保存條件（-80°C，佳pH，無氧氣）下，存在固定的降解速度：0.2%/天，因此配成溶液保存的D-熒光素應(yīng)盡量在1年內(nèi)使用完。
4.有水存在的情況下，主要發(fā)生消旋化作用，即D-熒光素轉(zhuǎn)化成L-熒光素，有報(bào)道稱L-熒光素對(duì)熒光素酶催化的酶促反應(yīng)有抑制作用。
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問：D-熒光素鈉鹽和D-熒光素鉀鹽有什么區(qū)別？
答：D-熒光素鈉鹽(貨號(hào)12511)的水溶性高于D-熒光素鉀鹽(貨號(hào)12507)，鈉鹽可以溶解到100 mg/mL，而鉀鹽只能溶解到60 mg/mL。
D-熒光素鈉鹽的外形更顆粒狀，而D-熒光素鉀鹽的外形更細(xì)膩。
兩者在動(dòng)物活體成像分析和體外生物發(fā)光檢測(cè)方面的效果基本相同，但有些文獻(xiàn)和研究者更傾向于使用鉀鹽。
問：D-熒光素鈉鹽鉀鹽在進(jìn)行體外標(biāo)記的時(shí)候，需要注意什么？
答：1.純度和質(zhì)量：使用高純度的D-熒光素鈉鹽，確保染料的質(zhì)量良好，避免雜質(zhì)對(duì)標(biāo)記結(jié)果的影響。
2.溶液配制：請(qǐng)按照說明書準(zhǔn)確配制熒光素鈉鹽的工作溶液。注意緩沖液的選擇，以確保標(biāo)記過程中維持適當(dāng)?shù)膒H值和離子濃度。
3.保護(hù)染料活性：D-熒光素鈉鹽可能對(duì)光敏感，因此在標(biāo)記過程中避免長(zhǎng)時(shí)間的強(qiáng)光照射，*好在低光條件下操作。另外，標(biāo)記溶液*好是在避光條件下保存，避免陽(yáng)光直射。
4.反應(yīng)時(shí)間：確保標(biāo)記反應(yīng)的時(shí)間充分但不過長(zhǎng)，以防止過度標(biāo)記和非特異性結(jié)合?？梢酝ㄟ^試驗(yàn)不同的反應(yīng)時(shí)間找到*適合的標(biāo)記時(shí)間。
5.染料與目標(biāo)物的比例：確定適當(dāng)?shù)臒晒馑剽c鹽與目標(biāo)物（如蛋白質(zhì)、細(xì)胞等）的比例，以實(shí)現(xiàn)*佳的標(biāo)記效果。過量的染料可能會(huì)引起背景噪音，而過少的染料則可能導(dǎo)致信號(hào)較弱。
6.洗滌步驟：完成標(biāo)記后，必須進(jìn)行適當(dāng)?shù)南礈觳襟E，去除未結(jié)合的熒光素鈉鹽和其他雜質(zhì)，以減少背景干擾。
7.驗(yàn)證標(biāo)記效果：在標(biāo)記完成后，使用熒光顯微鏡或其他熒光成像設(shè)備驗(yàn)證標(biāo)記效果，確保目標(biāo)物正確被標(biāo)記并發(fā)出熒光。
8.質(zhì)量控制：在進(jìn)行體外標(biāo)記實(shí)驗(yàn)時(shí)，*好同時(shí)進(jìn)行陰性對(duì)照和陽(yáng)性對(duì)照實(shí)驗(yàn)，以確保標(biāo)記的特異性和可靠性。
9.存儲(chǔ)條件：對(duì)于已標(biāo)記的樣品，選擇適當(dāng)?shù)拇鎯?chǔ)條件，確保標(biāo)記的穩(wěn)定性和長(zhǎng)期保存的可靠性。
問：能否總結(jié)一下市面現(xiàn)售的各種D-熒光素？它們都有什么特點(diǎn)？什么區(qū)別？
答：目前市面常見的D-熒光素的形式有：鉀鹽、鈉鹽、游離酸、甲酯、乙酯、半乳糖苷等，下面將分別介紹它們之間的區(qū)別，供參考。
1. D-熒光素鈉鹽和鉀鹽，D-熒光素鈉鹽和鉀鹽的區(qū)別主要在于它們的溶解度和穩(wěn)定性。D-熒光素鈉鹽的溶解度略高于鉀鹽，但是鉀鹽的穩(wěn)定性略高于鈉鹽。這是因?yàn)殁c離子對(duì)熒光素酶的活性有一定的抑制作用，而鉀離子則沒有。因此，如果實(shí)驗(yàn)條件允許，建議使用鉀鹽而不是鈉鹽。
2. D-熒光素游離酸，它在水和緩沖液中的溶解性很差，需要用弱堿如NaOH或KOH來調(diào)節(jié)pH才能溶解。而鈉鹽、鉀鹽則可以很容易地溶解在水或緩沖液中，無需額外處理。因此，鈉鹽、鉀鹽更適合體內(nèi)實(shí)驗(yàn)，而游離酸則需要更多的注意事項(xiàng)。
3. D-熒光素甲酯和乙酯，首先，甲酯或乙酯需要被脂肪酶水解后，才能釋放出D-熒光素。其次，兩者的區(qū)別主要在于它們的水解速率和發(fā)光強(qiáng)度。D-熒光素甲酯的水解速率比D-熒光素乙酯快，因此它的發(fā)光峰值出現(xiàn)得更早，但是也持續(xù)得更短。而D-熒光素乙酯的水解速率比D-熒光素甲酯慢，因此它的發(fā)光峰值出現(xiàn)得更晚，但是也持續(xù)得更長(zhǎng)。
4. D-熒光素半乳糖苷，它是一種用于檢測(cè)β-半乳糖苷酶活性的熒光底物，它需要經(jīng)過β-半乳糖苷酶的水解才能釋放出D-熒光素。
5. D-熒光素磷酸鹽，它在6-O位置上連接了一個(gè)磷酸基，使得它不能被螢火蟲熒光素酶識(shí)別。但是當(dāng)磷酸基被堿性磷酸酶或蛋白磷酸酶水解后，就會(huì)釋放出D-熒光素，這是一種可以被螢火蟲熒光素酶催化發(fā)光的底物。因此，D-熒光素磷酸鹽可以用于檢測(cè)堿性磷酸酶和蛋白磷酸酶的活性。
6. D-熒光素醋酸，它在6-O位置上連接了一個(gè)乙酸基，使得它不能被螢火蟲熒光素酶識(shí)別。但是當(dāng)乙酸基被酯酶水解后，就會(huì)釋放出D-熒光素，這是一種可以被螢火蟲熒光素酶催化發(fā)光的底物。因此，D-熒光素醋酸可以用于檢測(cè)酯酶的活性。
問：D-熒光素鉀鹽如何標(biāo)記小鼠？用量是多少？
答：1. 體外生物發(fā)光檢測(cè)：用無菌純凈水對(duì)D-熒光素鉀鹽進(jìn)行溶解，配制30mg/mL的儲(chǔ)備溶液，分裝后在-20℃避光條件下保存。在37℃恒溫條件下預(yù)熱處理組織培養(yǎng)基10-20分鐘，再將處理后的培養(yǎng)基倒入儲(chǔ)存液中，稀釋至0.15-0.3 mg/mL的工作液濃度。之后再去除混液中的細(xì)胞培養(yǎng)基。等待圖像分析前，向細(xì)胞內(nèi)添加熒光素工作液，恒溫37℃條件下孵育5-10 min，之后再進(jìn)行圖像分析。
2. 活體成像分析：采用無菌的DPBS緩沖液配制成為15 mg/mL的熒光素的儲(chǔ)存液，混勻。使用水系0.2 μm真是濾器過濾對(duì)儲(chǔ)備液進(jìn)行**處理，處理后可即使使用，或者在-20℃避光條件下保存。腹腔注射（i.p.）：按照150 mg/kg 的熒光素/體重濃度比例進(jìn)行注射；注射入體內(nèi)10-15 min后（等待光信號(hào)達(dá)到*強(qiáng)穩(wěn)定平臺(tái)期）之后，再進(jìn)行成像分析。
問：D-熒光素的熒光與什么有關(guān)？它對(duì)動(dòng)物有什么影響？
答：D-熒光素是螢火蟲熒光素酶的化學(xué)發(fā)光底物。它在存在 ATP 的情況下通過熒光素酶氧化脫羧產(chǎn)生光。 D-熒光素的熒光與熒光素酶的濃度、ATP的水平、Mg2+的存在、氧氣的供應(yīng)和反應(yīng)溫度等因素有關(guān)。D-熒光素不會(huì)影響動(dòng)物（沒有明顯毒性或**反應(yīng)）。
問：D-熒光素鉀鹽可以用于測(cè)定啟動(dòng)子相連的熒光素酶基因的表達(dá)嗎？
答：是的，D-熒光素鉀鹽可以用于測(cè)定啟動(dòng)子相連的熒光素酶基因的表達(dá)。該操作的基本步驟如下：
1. 構(gòu)建一個(gè)將靶啟動(dòng)子的特定片段插入到熒光素酶表達(dá)序列前方的報(bào)告基因質(zhì)粒，如pGL3-basic等。
2. 將要檢測(cè)的轉(zhuǎn)錄因子表達(dá)質(zhì)粒與報(bào)告基因質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染細(xì)胞，如HEK293T細(xì)胞或其它相關(guān)的細(xì)胞系。如果此轉(zhuǎn)錄因子能夠激活靶啟動(dòng)子，則熒光素酶基因就會(huì)表達(dá)，熒光素酶的表達(dá)量與轉(zhuǎn)錄因子的作用強(qiáng)度成正比。
3. 加入特定的熒光素酶底物，熒光素酶與底物反應(yīng)，產(chǎn)生熒光，通過檢測(cè)熒光的強(qiáng)度可以測(cè)定熒光素酶的活性，從而判斷轉(zhuǎn)錄因子是否能與此靶啟動(dòng)子片段有作用。
問：D-熒光素適合做哪些實(shí)驗(yàn)?
答：D-熒光素鉀鹽和5-氟-熒光素，作為L(zhǎng)uciferase的作用底物，常用于以下實(shí)驗(yàn)：
1. 報(bào)告基因分析
2. In vivo imaging (動(dòng)物活體成像)
3. In vitro imaging (細(xì)胞體外分析)
4. ATP測(cè)定
5. 其它luciferase及其基因相關(guān)的分析和研究工作
問：D-熒光素應(yīng)用于活體成像的基本原理是什么？
答：細(xì)胞中D-熒光素酶參與的化學(xué)發(fā)光反應(yīng)遵守酶促反應(yīng)的基本原理，在底物D-熒光素鉀過量的情況下，反應(yīng)產(chǎn)生的光子數(shù)（發(fā)光量）與細(xì)胞中的D-熒光素酶的量成正相關(guān)，從而可以推算出細(xì)胞的數(shù)量。
問：D-熒光素鉀鹽溶液的穩(wěn)定性是怎樣的？
D-熒光素鉀鹽易溶于水和緩沖液，溶解度可高達(dá)25mg/mL。一般使用濃度為3-15 mg/mL。
溶液的pH值、溶液中的氧氣和保存時(shí)間對(duì)其保存過程中的穩(wěn)定性非常重要。當(dāng)溶液的pH<6.5（發(fā)生水解作用）或>7.5（發(fā)生消旋化作用，D型轉(zhuǎn)化為L(zhǎng)型）的情況下，D-熒光素鉀鹽相對(duì)不穩(wěn)定。如果溶液中存在少量的氧氣，將加速D-熒光素鉀的降解速度。
D-熒光素配成溶液后，在佳的保存條件（-80°C，佳pH，無氧氣）下，存在固定的降解速度：0.2%/天，因此配成溶液保存的D-熒光素應(yīng)盡量在1年內(nèi)使用完。
有水存在的情況下，主要發(fā)生消旋化作用，即D-熒光素轉(zhuǎn)化成L-熒光素，有報(bào)道稱L-熒光素對(duì)熒光素酶催化的酶促反應(yīng)有抑制作用。
問：D-熒光素鉀鹽的保存和運(yùn)輸條件是什么？
保存條件：≤-20°C，避光，保持干燥。（在不打開包裝的條件下，可保存兩年時(shí)間）。
運(yùn)輸條件：高純度的D-熒光素鉀鹽可在短時(shí)間內(nèi)常溫條件下保存，運(yùn)輸條件為常溫。
原裝（沒有打開包裝）熒光素的包裝瓶中充有氬氣，保證其穩(wěn)定性，打開包裝后，請(qǐng)嚴(yán)格按照保存條件保存。
D-熒光素鉀鹽具有易溶于水的特性，其暴露于空氣中，易吸潮。在稱量過程中，請(qǐng)考慮其易吸潮的特性，先進(jìn)行溫度平衡，再快速稱取。