「百螢Annexin V-iFluor 700標(biāo)記簡(jiǎn)介」
膜聯(lián)蛋白是鈣依賴性磷脂結(jié)合蛋白家族。 它們富含真核生物，屬于參與信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的普遍存在的細(xì)胞質(zhì)蛋白家族。 膜聯(lián)蛋白V的優(yōu)先結(jié)合配偶體是磷脂酰絲氨酸（PS），其通常保持在細(xì)胞膜的內(nèi)葉（細(xì)胞質(zhì)側(cè)）。在細(xì)胞凋亡中，PS被轉(zhuǎn)移到質(zhì)膜的外部小葉。磷脂酰絲氨酸在細(xì)胞表面上的出現(xiàn)是細(xì)胞凋亡的初始/中間階段的通用指示，并且可以在觀察到形態(tài)變化之前檢測(cè)到。我們的膜聯(lián)蛋白V結(jié)合物是一組監(jiān)測(cè)細(xì)胞功能的工具，旨在通過(guò)測(cè)量磷脂酰絲氨酸的易位來(lái)監(jiān)測(cè)細(xì)胞凋亡。
膜聯(lián)蛋白V結(jié)合物在Ca2+存在下與凋亡細(xì)胞表面上的PS結(jié)合，它也可以通過(guò)壞死細(xì)胞膜或死細(xì)胞并與細(xì)胞內(nèi)部的PS結(jié)合。因此，我們建議將細(xì)胞不可滲透的核染色與膜聯(lián)蛋白V結(jié)合物結(jié)合使用，以區(qū)分死細(xì)胞和凋亡細(xì)胞。
「百螢Annexin V-iFluor 700標(biāo)記適用儀器」
流式細(xì)胞儀、熒光顯微鏡
「百螢Annexin V-iFluor 700標(biāo)記實(shí)驗(yàn)方案」
概述
用測(cè)試化合物（200μL/樣品）制備細(xì)胞
添加Annexin V結(jié)合物測(cè)定溶液
室溫孵育30-60分鐘
用流式細(xì)胞儀或熒光顯微鏡分析
1.用膜聯(lián)蛋白V綴合物制備和孵育細(xì)胞：
1.1制備膜聯(lián)蛋白V結(jié)合測(cè)定緩沖液：10mM HEPES，140mM NaCl和2.5mM CaCl2，pH 7.4。
1.2用測(cè)試化合物處理細(xì)胞一段所需的時(shí)間（用星形孢菌素處理的Jurkat細(xì)胞4-6小時(shí)）以誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。
1.3離心細(xì)胞，得到1-5×105個(gè)細(xì)胞/管。
1.4將細(xì)胞重懸于200μL膜聯(lián)蛋白V結(jié)合測(cè)定緩沖液中（來(lái)自步驟1.1）。
1.5在細(xì)胞中加入2μL膜聯(lián)蛋白V結(jié)合物。
可選：在細(xì)胞內(nèi)加入死細(xì)胞染色劑如碘化丙錠，用于壞死細(xì)胞。
1.6在室溫下孵育30至60分鐘，避光。
1.7在用流式細(xì)胞儀或熒光顯微鏡分析細(xì)胞之前，加入300μL膜聯(lián)蛋白V結(jié)合測(cè)定緩沖液（來(lái)自步驟1.1）以增加體積（參見(jiàn)下面的步驟1.8）。
1.8使用流式細(xì)胞儀或熒光顯微鏡監(jiān)測(cè)熒光強(qiáng)度（參見(jiàn)下面的步驟2或3）。
2.使用流式細(xì)胞儀分析：
通過(guò)使用具有適當(dāng)過(guò)濾器的流式細(xì)胞儀來(lái)量化膜聯(lián)蛋白V綴合物。
注意：粘附細(xì)胞上的膜聯(lián)蛋白V結(jié)合流式細(xì)胞術(shù)分析未經(jīng)常檢測(cè)，因?yàn)樵诩?xì)胞分離或收獲期間可能發(fā)生特定的膜損傷。
3.使用熒光顯微鏡分析：
3.1移取步驟1.6的細(xì)胞懸液，用膜聯(lián)蛋白V結(jié)合測(cè)定緩沖液（來(lái)自步驟1.1）沖洗1-2次，然后用膜聯(lián)蛋白V結(jié)合測(cè)定緩沖液（來(lái)自步驟1.1）重懸細(xì)胞。將細(xì)胞添加到蓋有玻璃蓋玻片的載玻片上。
注意：對(duì)于粘附細(xì)胞，建議直接在蓋玻片上生長(zhǎng)細(xì)胞。 與膜聯(lián)蛋白V綴合物孵育（步驟1.6）后，用膜聯(lián)蛋白V結(jié)合測(cè)定緩沖液（來(lái)自步驟1.1）沖洗1-2次，并將膜聯(lián)蛋白V結(jié)合測(cè)定緩沖液（來(lái)自步驟1.1）加回到蓋玻片中。 在玻璃載玻片上翻轉(zhuǎn)蓋玻片并觀察細(xì)胞。在與膜聯(lián)蛋白V綴合物孵育后，細(xì)胞也可以在2％甲醛中固定，并在顯微鏡下觀察。
3.2在熒光顯微鏡下用適當(dāng)?shù)臑V光片分析膜聯(lián)蛋白V綴合物的凋亡細(xì)胞
「百螢Annexin V-iFluor 700標(biāo)記數(shù)據(jù)分析」
下圖是使用流式細(xì)胞儀檢測(cè)膜聯(lián)蛋白V-mFluor Violet 450與磷脂酰絲氨酸在Jurkat細(xì)胞凋亡中的結(jié)合活性的實(shí)例。在活的非凋亡細(xì)胞中，膜聯(lián)蛋白V-mFluor Violet 450檢測(cè)非誘導(dǎo)細(xì)胞中的先天性細(xì)胞凋亡，其通常為所有細(xì)胞的2-6％。在凋亡細(xì)胞中，膜聯(lián)蛋白V-mFluor Violet 450與磷脂酰絲氨酸結(jié)合，磷脂酰絲氨酸位于細(xì)胞膜的外部小葉上，導(dǎo)致染色強(qiáng)度增加。
圖1.在Jurkat細(xì)胞中檢測(cè)膜聯(lián)蛋白VmFluor Violet 450和磷脂酰絲氨酸的結(jié)合活性。將Jurkat細(xì)胞在37℃，5％CO2培養(yǎng)箱中不用（藍(lán)色）或用1μM星形孢菌素（紅色）處理5小時(shí)，然后用Annexin V-mFluor Violet 450染色30分鐘。使用FACSCalibur（Becton Dickinson，San Jose，CA）流式細(xì)胞儀，使用紫外激光在Ex / Em = 405 / 450nm下測(cè)量膜聯(lián)蛋白V-mFluor Violet 450的熒光強(qiáng)度。