Cy(Cyanine),也叫花青染料，是一系列在實(shí)驗(yàn)中很常見的熒光化合物。跟著百螢一起看看它們是怎么工作的吧！

1.問：Cy3、Cy5、Cy7是什么？光譜特性如何？適用于哪些應(yīng)用？

答：Cy3、Cy5和Cy7是一類熒光染料，常用于生物科學(xué)研究中的熒光標(biāo)記和成像。它們屬于氰化染料家族，可以在特定波長(zhǎng)下吸收光能，并在不同波長(zhǎng)下發(fā)射特定顏色的熒光信號(hào)。

Cy3的大吸收波長(zhǎng)約為550納米，大發(fā)射波長(zhǎng)約為570納米；Cy5的大吸收波長(zhǎng)約為650納米，大發(fā)射波長(zhǎng)約為670納米；Cy7的大吸收波長(zhǎng)約為750納米，大發(fā)射波長(zhǎng)約為770納米。

Cy3、Cy5和Cy7廣泛應(yīng)用于分子生物學(xué)和細(xì)胞生物學(xué)研究中的熒光標(biāo)記。它們常用于熒光顯微鏡觀察、流式細(xì)胞術(shù)、免yi熒光染色、蛋白質(zhì)和核酸定量等實(shí)驗(yàn)中。

2.問：Cy3NHS酯在動(dòng)物活體實(shí)驗(yàn)中的注意事項(xiàng)有哪些？

答：（1）Cy3標(biāo)記物在使用前需要稀釋到合適的濃度和pH值。一般推薦使用PBS或TBS緩沖液稀釋，避免使用含有氨基或巰基的緩沖液或添加劑，以防止與Cy3發(fā)生反應(yīng)或還原。Cy3標(biāo)記物的稀釋比例根據(jù)實(shí)驗(yàn)?zāi)康暮蜅l件而定，一般在1:200-1:1000之間。

（2）Cy3標(biāo)記物在使用過程中需要避免光照和高溫，以防止熒光淬滅或降解。Cy3標(biāo)記物可以在4°C避光保存數(shù)月，或者在-20°C避光保存數(shù)年。如果需要凍存，可以加入適量的甘油或DMSO作為凍存保護(hù)劑。

（3）Cy3標(biāo)記物在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中可以用于尾靜脈注射，進(jìn)行活體成像。每次注射200μL（濃度0.5 mg/mL），每5分鐘記錄一張動(dòng)物在體內(nèi)發(fā)射熒光的成像圖片，分析熒光**的分布情況。對(duì)照鼠不注射**，進(jìn)行同時(shí)記錄。

3.問：磺化和非磺化的Cy3有什么區(qū)別？哪個(gè)更適合蛋白染色？

答：磺化的Cy3和非磺化的Cy3的主要區(qū)別是水溶性和標(biāo)記方法?；腔?/span>Cy3在發(fā)色團(tuán)上有兩個(gè)硫酸離子官能團(tuán)，所以它的水溶性很高，可以直接在水溶液中進(jìn)行標(biāo)記反應(yīng)，不需要有機(jī)溶劑助溶1。非磺化的Cy3的水溶性較低，需要預(yù)先溶解在有機(jī)溶劑（如DMF或DMSO）中，然后加入到生物分子的水溶液中反應(yīng)。如果被標(biāo)記的蛋白質(zhì)對(duì)有機(jī)溶劑敏感，或者需要通過透析純化，那么磺化的Cy3是更好的選擇。另外，磺化的Cy3也有更好的光學(xué)穩(wěn)定性和量子產(chǎn)率，發(fā)出的熒光更強(qiáng)更耐光照。兩種Cy3的熒光譜圖幾乎一樣，只是磺化的Cy3有微小的藍(lán)移。因此，在大多數(shù)情況下，兩種Cy3可以相互替換使用。百螢生物提供多種基團(tuán)的Cy染料，歡迎選購(gòu)

4.問：Cy3標(biāo)記植物組織和動(dòng)物組織，在實(shí)驗(yàn)操作上有什么區(qū)別？

答：Cy3標(biāo)記植物組織和動(dòng)物組織在操作上的區(qū)別可能取決于不同的實(shí)驗(yàn)?zāi)康暮头椒?，但是一般來說，有以下幾點(diǎn)需要注意：

（1）植物組織通常有較厚的細(xì)胞壁，可能影響染料的滲透和結(jié)合。因此，在標(biāo)記前可能需要用酶或機(jī)械方法處理植物組織，增加其滲透性；

（2）植物組織和動(dòng)物組織的pH值可能不同，這可能影響染料的穩(wěn)定性和熒光強(qiáng)度。因此，在選擇緩沖液時(shí)，需要考慮目標(biāo)組織的pH值，并且避免使用含有氨基的緩沖液，如Tris或甘氨酸，以免與染料競(jìng)爭(zhēng)反應(yīng)；

（3）Cy3染料有脂溶性和水溶性兩種類型，脂溶性染料需要加入有機(jī)溶劑助溶，而水溶性染料不需要，水溶性染料通常更穩(wěn)定，更適合標(biāo)記對(duì)有機(jī)溶劑敏感的生物分子；

（4）Cy3染料可以與生物分子上的氨基反應(yīng)形成穩(wěn)定的酰胺鍵，因此在標(biāo)記時(shí)需要控制反應(yīng)條件和比例，以達(dá)到理想的標(biāo)記效率和熒光信號(hào)。一般來說，Cy3染料與目標(biāo)分子的摩爾比在4-12之間為宜。

5.問：Cy5 馬來酰亞胺能否標(biāo)記外泌體？如何操作？

答：Cyanine 5 maleimide是一種熒光染料，常用于對(duì)含有巰基的蛋白質(zhì)或肽鏈進(jìn)行標(biāo)記。該產(chǎn)品可以標(biāo)記外泌體，以下是一般的標(biāo)記步驟：

（1）準(zhǔn)備外泌體樣品：收集并純化外泌體樣品，確保樣品的純度和完整性。

（2）選擇適當(dāng)?shù)木彌_液：根據(jù)實(shí)驗(yàn)需求選擇合適的緩沖液，例如磷酸鹽緩沖液（PBS）。

（3）制備Cyanine 5 maleimide工作溶液：根據(jù)說明書，將Cyanine 5 maleimide溶解在適當(dāng)?shù)娜軇┲?，制備成工作濃度的溶液?/span>

（4）反應(yīng)標(biāo)記：將外泌體樣品與Cyanine 5 馬來酰亞胺工作溶液混合，使其反應(yīng)。反應(yīng)時(shí)間和溫度可以根據(jù)實(shí)驗(yàn)需求進(jìn)行優(yōu)化，一般在室溫或較低溫下進(jìn)行。

（5）反應(yīng)停止：添加還原劑（如二巰基乙醇）以停止反應(yīng)，并消除未反應(yīng)的Cyanine 5 馬來酰亞胺。

（6）清洗和去除未結(jié)合的染料：使用適當(dāng)?shù)南礈炀彌_液，如PBS，對(duì)標(biāo)記后的外泌體樣品進(jìn)行洗滌，以去除未結(jié)合的染料。

（7）分析和評(píng)估：使用熒光顯微鏡、流式細(xì)胞術(shù)或其他適當(dāng)?shù)募夹g(shù)，對(duì)標(biāo)記后的外泌體樣品進(jìn)行熒光檢測(cè)和分析。

6.問：Cy3酸和NHS酯有什么區(qū)別？適用性有什么不同？

答：Cy3 acid（貨號(hào)140）和NHS酯（貨號(hào)141）都是一種黃色熒光染料，用于標(biāo)記生物分子中的氨基。它們的區(qū)別在于反應(yīng)基團(tuán)的不同。Cy3 acid是一種羧酸，可以與活化劑（如EDC）反應(yīng)，形成活化羧酸，再與氨基反應(yīng)。Cy3 NHS酯是一種N-羥基琥珀酰亞胺酯（NHS酯），可以直接與氨基反應(yīng)，形成穩(wěn)定的酰胺鍵。

Cy3 acid和NHS酯的適用性也有不同。Cy3 acid可以用于標(biāo)記含有羧基的分子，如核酸，通過轉(zhuǎn)化為NHS酯或其他活化形式。Cy3 NHS酯可以用于標(biāo)記含有氨基的分子，如蛋白質(zhì)，多

肽，或氨基修飾的核苷酸。Cy3 NHS酯比Cy3 acid更方便使用，因?yàn)椴恍枰~外的活化步驟。

7.問：Cy3馬來酰亞胺常用于什么染色？它和Cy3NHS酯的區(qū)別是什么？

答：Cy3馬來酰亞胺（貨號(hào)142）常用于標(biāo)記含有巰基的生物分子，比如半胱氨酸和雙硫鍵等，然后用熒光顯微鏡或熒光酶標(biāo)儀觀察或檢測(cè)它們的熒光信號(hào)。它和Cy3NHS酯（貨號(hào)141）的區(qū)別主要在于：

（1）Cy3馬來酰亞胺可以和巰基反應(yīng)，而Cy3NHS酯可以和胺基反應(yīng)。

（2）Cy3馬來酰亞胺的標(biāo)記反應(yīng)比Cy3NHS酯的標(biāo)記反應(yīng)更快、更高效、更特異。

（3） Cy3馬來酰亞胺的水溶性較低，需要使用有機(jī)共溶劑，而Cy3NHS酯的水溶性較高，不需要使用有機(jī)共溶劑。

8.問：Cy3NHS酯和Cy3雙NHS酯在蛋白染色方面有什么區(qū)別？

答：在染色方面的區(qū)別主要是：

Cyanine 3 雙NHS酯（貨號(hào)138）含有兩個(gè)NHS基團(tuán)，可以與兩個(gè)氨基反應(yīng)，形成雙綴合物。這種染料可能會(huì)在一些蛋白質(zhì)上產(chǎn)生更高的熒光信號(hào)，但也可能會(huì)增加非特異性結(jié)合的風(fēng)險(xiǎn)。

Cyanine 3 NHS酯（貨號(hào)141）含有一個(gè)NHS基團(tuán)，只能與一個(gè)氨基反應(yīng)，形成單綴合物 。這種染料是一種常用的染料，可以與多種生物分子發(fā)生共價(jià)結(jié)合，但也可能會(huì)降低熒光信號(hào)的強(qiáng)度。

對(duì)于Cyanine 3 雙NHS酯，常用于標(biāo)記含有多個(gè)氨基的生物分子，如多肽、蛋白質(zhì)、寡核苷酸等，也可以用于高靈敏度的熒光檢測(cè)，因?yàn)?/span>Cyanine 3 雙NHS酯在與蛋白質(zhì)結(jié)合后熒光大幅度增強(qiáng)。

Cy3 雙NHS酯注意事項(xiàng)：

（1）避免與含有羧基或硫醇基的生物分子反應(yīng)，因?yàn)檫@些基團(tuán)可能會(huì)與NHS基團(tuán)競(jìng)爭(zhēng)，導(dǎo)致非特異性結(jié)合或副反應(yīng)。

（2）避免在強(qiáng)酸或強(qiáng)堿的條件下使用，因?yàn)檫@些條件可能會(huì)破壞染料的結(jié)構(gòu)或熒光性能。