1.什么是螢光素/螢光素酶反應(yīng)?它如何起作用？
在自然界中，當(dāng)化學(xué)能轉(zhuǎn)化為光能時(shí)，就會(huì)發(fā)生生物發(fā)光。螢火蟲，**和海洋生物等許多生物都出于多種原因出現(xiàn)生物發(fā)光。當(dāng)螢光素酶催化螢光素的氧化導(dǎo)致發(fā)光時(shí)，就會(huì)發(fā)生該過程。反應(yīng)機(jī)理如下圖所示：
2.螢光素酶檢測的主要目的是什么？
螢光素酶是檢測啟動(dòng)子強(qiáng)度和活性的好方法。例如，如果您想研究啟動(dòng)子區(qū)域內(nèi)的轉(zhuǎn)錄，可以將熒光素酶基因置于啟動(dòng)子后面。轉(zhuǎn)錄該基因后，您將根據(jù)產(chǎn)生的熒光強(qiáng)度知道自己是否具有強(qiáng)大的啟動(dòng)子。檢測中產(chǎn)生更強(qiáng)的熒光意味著更多的熒光素酶被轉(zhuǎn)錄，這意味著您具有更強(qiáng)的啟動(dòng)子。 您也可能會(huì)遇到的另一個(gè)問題是，如果要檢測基因表達(dá)，何時(shí)選擇熒光素酶測定法，何時(shí)選擇qPCR。要記住的是：qPCR方法將測量基因的轉(zhuǎn)錄本。它不會(huì)告訴您轉(zhuǎn)錄的控制。但是，使用螢光素酶可以測量啟動(dòng)子的和轉(zhuǎn)錄調(diào)控。還要考慮的另一件事是，您想要研究基因調(diào)控的深度。您可能會(huì)發(fā)現(xiàn)，必須同時(shí)執(zhí)行這兩種技術(shù)才能了解項(xiàng)目的主要方面。
3.我需要什么進(jìn)行熒光素酶檢測？
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領(lǐng)域
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研究類型
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試劑
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儀器
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孔板/管
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生物光學(xué)成像
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細(xì)胞、活體動(dòng)物（如：小鼠）
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熒光素酶檢測試劑/熒光素酶檢測試劑盒
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酶標(biāo)儀/單管發(fā)光儀
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微孔板/微量離心管
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注：
1.試劑：您可以選擇一個(gè)試劑盒來進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，它會(huì)包含您需要的所有必要成分；您也可以選擇試劑，再配制或購買其他實(shí)驗(yàn)中的必要成分。如果您購買的是單獨(dú)的產(chǎn)品，那么我們建議您考慮質(zhì)量，尤其是在熒光素方面。純度的差異會(huì)產(chǎn)生影響。而試劑盒具有相當(dāng)大的便利性，例如，您不必制作緩沖液，因?yàn)樵噭┖兄幸呀?jīng)提供了它。制備螢光素儲(chǔ)液時(shí)，無需稱量，因?yàn)槟奈灩馑匾呀?jīng)過測量。它還在您的實(shí)驗(yàn)設(shè)置中提供了統(tǒng)一性。
2.儀器：首先檢查您的儀器是酶標(biāo)儀還是單管發(fā)光儀，找出您的儀器是否帶有進(jìn)樣器。并找出您的儀器在什么波長下工作以及在什么溫度下工作。所有這些都將幫助您進(jìn)一步規(guī)劃實(shí)驗(yàn)。（酶標(biāo)儀允許您讀取孔板中的樣品。通常范圍在96到384之間；單管發(fā)光儀，將讀取單個(gè)微量離心管。）
3.孔板/管：對于這種測定類型，必須使用平坦的底板（不要使用圓底的孔板）。它們是專門為光學(xué)檢查和細(xì)胞培養(yǎng)應(yīng)用而設(shè)計(jì)的。透明的孔板使您可以看到裂解物，但缺點(diǎn)是相鄰的孔中的背景可能會(huì)影響您的觀察。白色的孔板可以防止出現(xiàn)這種背景。但是，您看不到自己的裂解物。底部透明的白板可以解決可見性和背景問題，但價(jià)格昂貴。如何選擇，取決于您的實(shí)驗(yàn)需求及資金。
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4.螢光素酶檢查的基本步驟是什么？
熒光素酶檢查的步驟非常相似，您是進(jìn)行雙重報(bào)告基因分析還是單個(gè)報(bào)告基因。基本步驟如下：
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a. 選擇熒光素酶報(bào)道基因（螢火蟲熒光素酶或海腎熒光素酶等）。如果要進(jìn)行雙重報(bào)告基因檢測，則螢光素酶需要進(jìn)行不同的光譜檢查。
b. 將報(bào)告基因克隆到質(zhì)粒中。如果您要進(jìn)行雙重報(bào)告基因檢測，則將其他報(bào)告基因克隆到單獨(dú)的質(zhì)粒中。
c. 將質(zhì)粒與實(shí)驗(yàn)細(xì)胞共轉(zhuǎn)染。
d. 經(jīng)過24至48小時(shí)培養(yǎng)后，取出培養(yǎng)基并裂解細(xì)胞。
e. 將包含螢光素的緩沖液添加到裂解物中，使用酶標(biāo)儀進(jìn)行檢測。
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這些是您可以遵循的一般步驟。實(shí)際情況應(yīng)根據(jù)您要執(zhí)行的分析類型和實(shí)驗(yàn)?zāi)繕?biāo)，調(diào)整實(shí)驗(yàn)方法。
相關(guān)試劑
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分類
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品名
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貨號
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Ex/Em（nm）
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試劑
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熒光素酶*重組熒光素*
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#12500
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/
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D-熒光素游離酸
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#12501/#12502/#12503
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328/533
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D-熒光素鉀鹽
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#12505/#12506/#12507
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328/533
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D-熒光素鈉鹽
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#12509/#12510/#12511
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328/533
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D-熒光素磷酸鹽
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#12512
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328/533
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D-熒光素半乳糖苷
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#12513
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328/533
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D-熒光素甲酯
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#12514
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328/533
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D-熒光素乙酯
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#12515
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328/533
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D-熒光素醋酸
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#12516
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328/533
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試劑盒
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Amplite 熒光素酶報(bào)告基因檢測試劑盒
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#12518/#12519/#12520
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/
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Amplite 高斯熒光素酶報(bào)告基因檢測試劑盒
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#12530/#12531/#12532
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429/466
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Amplite 海腎熒光素酶報(bào)告基因檢測試劑盒
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#12535/#12536/#12537
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429/466
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