用于定義細胞活力的參數(shù)，例如細胞膜完整性、線粒體膜電位和細胞內(nèi)脂酶活性，可以共同用于區(qū)分活細胞和死細胞群，確定細胞活力，并篩選化合物的細胞毒性。這些參數(shù)構成了一些策略的基礎，例如我們的Live or Dead細胞活性檢測試劑盒，該試劑盒結合了兩種熒光探針：活細胞脂酶底物和細胞不可滲透的DNA結合染料，以在樣品中實現(xiàn)兩種顏色的活細胞和死細胞區(qū)分。Live or Dead 檢測可用于通過熒光顯微鏡、流式細胞儀或熒光測定法檢查真核細胞和X菌。

 

Live or Dead細胞活性測定原理

AAT Bioquest的 Live or Dead細胞活性檢測試劑盒是基于使用兩種熒光探針同時測定活細胞和死細胞。活細胞的標記使用酮酸酯（Acetoxymethyl，AM）衍生物的草銨綠（calcein）或線粒體膜電位探針，而死細胞的標記使用細胞不可滲透的DNA結合染料。酮酸酯衍生物是非熒光脂酶底物，很容易擴散穿過完整的細胞膜并滲透到活細胞中。一旦進入細胞，非特異性細胞內(nèi)脂酶將底物水解為熒光產(chǎn)物，將其固定在細胞內(nèi)。底物發(fā)出的熒光信號是活細胞具有脂酶活性和完整膜的指示器。另外，線粒體膜電位探針也可用于區(qū)分活細胞。這些可滲透膜的陽離子染料被 passively 沿著細胞膜擴散，并在健康細胞的線粒體內(nèi)積累，產(chǎn)生顯著的熒光信號。相反，失去線粒體膜電位的死細胞將排除該染料，并且不會觀察到信號。這種細胞不可滲透的DNA結合染料選擇性的與DNA結合，具有高親和力，只能穿透死細胞受損的膜，并在與核酸結合后會發(fā)出明顯的熒光。然而，具有完整細胞膜的健康活細胞將阻止該染料進入細胞，從而產(chǎn)生負信號。由于細胞活性的測定取決于這些物理特性，不影響這些參數(shù)的細胞毒性事件可能無法準確地使用這些方法評估。

 

 

Live or Dead真核細胞檢測

Live or Dead細胞活性檢測試劑盒“紅/綠雙色熒光”

 

Live or Dead細胞活性檢測試劑盒“紅/綠雙熒光”是一種快速簡便的試劑盒，用于準確測定真核細胞中的細胞活力和細胞毒性。該試劑盒包含兩種探針：CytoCalcein Green和碘化丙錠，可以同時添加到樣品中，通過雙熒光區(qū)分活細胞和死細胞，而無需任何洗滌步驟。CytoCalcein Green是一種熒光脂酶底物，可以用綠色熒光標記具有脂酶活性的活細胞，同時，碘化丙錠是一種不可滲透細胞膜的核酸染料，可以用紅色熒光標記死細胞。該試劑盒可以輕易適用于各種熒光平臺的高通量測定，包括熒光酶標儀，成像系統(tǒng)和流式細胞儀，并且與3D細胞培養(yǎng)模型、球體、貼壁細胞、非貼壁細胞和某些組織兼容。與其他評估細胞活力的替代方法（如臺盼藍排除實驗或鉻釋放實驗）相比，相比，Live or Dea 細胞活性檢測試劑盒在定義細胞毒性事件方面更an全、更經(jīng)濟、更敏感。

圖1.活細胞或死細胞活性的影像學檢測。用Live或Dead細胞活性檢測試劑盒分析90%活細胞，0%固定細胞和兩個細胞的混合物（活/固定=50/50），并用熒光顯微鏡在FITC和TRITC通道中成像。

Live or Dead細胞活性檢測試劑盒“紅/綠雙色熒光”優(yōu)點：

1. 對活細胞和死細胞進行穩(wěn)定且有選擇性的雙熒光染色；

2. 該試劑盒采用快速簡單的一步染色程序，可以同時添加兩種探針；

3. 無需洗滌使其非常適合高通量篩選應用；

4. 該試劑盒可通過熒光顯微鏡、流式細胞術和熒光酶標儀檢測；

5. 適用于貼壁和非貼壁細胞。

Live or Dead細胞活性檢測試劑盒“紅/藍雙色熒光”

Live or Dead細胞活性檢測試劑盒“紅/藍雙色熒光”是一種方便的試劑盒，基于細胞膜完整性和線粒體膜電位活性來確定細胞活力和細胞毒性。該試劑盒具有兩種探針Cellbrite^TM Red和Nuclear Blue^TM DCS1,可以同時添加到樣品中，用于活細胞和死細胞的雙色熒光測定。ellbrite^TM Red能夠?qū)⒕哂谢钴S線粒體的活細胞染成紅色，而不可滲透膜的DNA染料Nuclear Blue^TM DCS1將死細胞染成藍色。該試劑盒可以輕松適用于多種熒光平臺的高通量分析，如熒光酶標儀分析，免yi細胞化學，成像與流式細胞術，并且與3D細胞培養(yǎng)模型、球體、貼壁細胞和非貼壁細胞兼容。

圖2.Live or Dead 細胞活力檢測試劑盒（雙熒光）（Cat#22788）標記的HeLa細胞的熒光圖像。HeLa細胞以每孔100,000個細胞/100 μL的密度在96孔黑壁/透明底板上過夜培養(yǎng)。細胞在37°C下用0-1 μM的staurosporine（SS）處理4小時（A-D），或者用乙醇固定（E），然后與染料加載溶液孵育1小時。分別使用Texas Red或Cy5濾光片測量活細胞（紅色）和死亡細胞（藍色）的熒光信號。相應的熒光信號使用FlexStation®熒光酶標儀（Molecular Devices）在底部讀取模式下進行測量，波長分別為Ex/Em = 610/650（Cutoff=630 nm，紅色）和Ex/Em = 360/450（cutoff=420 nm，藍色）。

表1.真核細胞Live or Dead 細胞活性測定選擇指南

1. FC=流式細胞術 FM=熒光顯微鏡 MA=微孔板測定

Live or DeadX菌檢測

MycoLight熒光活/死X菌成像試劑盒

MycoLight熒光活/死X菌成像試劑盒提供了一種快速簡便的方法來區(qū)分懸浮或固定在濾膜上的活X菌或死X菌。該試劑盒包含兩種探針：MycoLight520和碘化丙錠，可以同時添加到X菌樣品中，無需任何洗滌步驟，非常適合高通量篩選。MycoLight520是一種能穿透X菌質(zhì)膜的熒光酯酶底物，能夠通過被動擴散進入X菌的質(zhì)膜，并將活X菌染成綠色。相反，碘化丙錠只能滲透受損的X菌膜，將死X菌標記為紅色熒光。因此，通過適當混合MycoLight? 520和碘化丙錠染料，具有完整細胞膜的活X菌發(fā)出綠色熒光，并使用標準熒光素濾光片進行分析，而受損細胞膜的死X菌發(fā)出紅色熒光，并使用標準TRITC濾光片進行分析。

圖3.用MycoLight 熒光活/死X菌成像試劑盒染色活的和死的枯草芽孢桿菌的混合群體。 具有活性細胞內(nèi)酯酶的活細X顯示綠色熒光，而70%酒精殺死的細胞膜受損的死細胞則顯示紅色熒光。

表二.MycoLight熒光活/死X菌成像試劑盒

Live or Dead流式細胞術固定分析

能夠區(qū)分和排除死細胞的能力，實現(xiàn)了對細胞群體的清晰分離和鑒定，這大大提高了實驗的準確性，消除了各種試劑與死細胞的非特異性結合所引起的bu良偽影和假陽性。為了從流式細胞儀讀數(shù)中區(qū)分活細胞和死細胞群體，AAT Bioquest提供了多種Live or Dead可固定性死細胞染色試劑盒。標記穩(wěn)定、高效，并且與固定劑和滲透緩沖液兼容，從而可以進一步分析細胞內(nèi)靶標。

Live or Dead固定化死細胞標記試劑盒

使用無法穿透細胞膜的胺基反應性染料，在流式細胞儀中區(qū)分活細胞和死細胞。每個試劑盒提供的染料可以輕松滲透受損的死細胞膜，并共價結合到細胞內(nèi)外的含有胺基的蛋白質(zhì)上，產(chǎn)生強烈的熒光信號。而在活細胞上，熒光信號微弱，因為細胞表面的胺基僅可與染料反應?；罴毎退兰毎后w之間信號強度的差異明顯，因此很容易將死細胞排除在分析之外。使用Live or Dead固定化死細胞標記試劑盒的標記的細胞可以被固定、滲透化處理，并用于細胞內(nèi)免yi表型分析或其他多參數(shù)染色實驗。AAT Bioquest提供多種Live or Dead固定化死細胞標記試劑盒，設計用于有效激發(fā)主要的激發(fā)源，包括350、405、488、532、561、633和647 nm激光線，并在常見通道發(fā)射。這些試劑盒是保存特定細胞的熒光圖像的工具，也可用于熒光顯微鏡演示。

表三.用于流式細胞術的Live or Dead固定化死細胞標記試劑盒